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客户文章丨复合材料的动态降解模式协调巨噬细胞反应和免疫调节性骨再生
发布日期:2022-12-29浏览:

导语

 

2022年8月6日,陕西第四军医大学唐都医院在《Bioactive Materials》上发表题为“Dynamic degradation patterns of porous polycaprolactone/β-tricalcium phosphate composites orchestrate macrophage responses and immunoregulatory bone regeneration”的文章,建立了一个稳定的体外降解模型来研究生物可降解聚己内酯/β-磷酸三钙(PT)支架在降解过程中的物理化学和生物学性质的变化。

dafabet手机黄金版有幸为实验部分提供了mRNA测序技术和服务。

 

下面就由小编和大家分享该文章

 

 

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发表期刊:Bioactive Materials

影响因子:16.874

发表时间:2022.08

作者单位:陕西第四军医大学唐都医院

研究方法:mRNA-seq

文章链接:Dynamic degradation patterns of porous polycaprolactone/β-tricalcium phosphate composites orchestrate macrophage responses and immunoregulatory bone regeneration

 

文章概要

生物降解聚己内酯/β-磷酸三钙(PT)复合材料是骨组织工程应用的理想候选材料。本研究验证了具有不同成分的PCL/β-TCP支架在降解的每个阶段对骨愈合的影响都有很大不同。PT46和PT37支架比TCP含量较低的PT支架降解得更快,体内实验表明PT(PT46和PT37)支架的快速降解扰乱了巨噬细胞反应,导致骨愈合失败。PT37支架降解产物的吞噬作用诱导巨噬细胞中的氧化应激和炎症M1极化。本研究揭示了可降解骨支架生物降解的动态模式高度协调免疫反应,从而决定了骨再生的成功。因此,通过评估生物材料在整个降解过程中对免疫反应和骨再生的生物效应,有必要开发更具前景的骨再生生物材料。

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技术路线

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研究结果

1.3D打印PCL/β-TCP复合支架的理化和成骨性能表征

研究团队制作了一系列生物活性PCL/TCP(PT)支架,通过SEM、micro-CT评估了表面形态,并进行了压缩测试、热性能测试以及验证了对成骨细胞的成骨作用,发现具有更高TCP含量的支架导致增强的ALP活性,尤其是PT37支架。

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2.支架生物降解动态降解模型的构建

接着,研究团队设计并开发了一种先进的动态生物降解反应器来模拟体内生物降解环境,研究了几种先前报道的降解介质对动态降解反应器中PT支架降解的影响。观察到稀氢氧化钠溶液诱导稳定的降解模式类似于体内植入的支架的降解模式,体外降解支架的micro-CT横截面也证实了动态降解反应器的功效。

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3.PCL/β-TCP支架成分对体内骨再生的影响

体内实验发现,相较于PT73、PT64和PT55支架,PT46和PT37支架诱导异常的骨再生模式: 在4周时快速骨新生,在10周和16周时延迟骨形成

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4.PT支架降解模式对免疫反应和巨噬细胞极化的影响

通过SEM、残留支架的微型CT重建和分割,均证实了PT73、PT64和PT55支架的稳定降解以及PT46和PT37支架的快速降解两种模式 。期间,Masson染色切片的高倍率成像显示了大量的多核巨细胞 (mngc) 散布在PT46和PT37支架的支架区。为了探究快速降解对巨噬细胞反应后期的影响,作者通过组织免疫荧光染色研究修复过程中不同阶段PT支架内巨噬细胞的极化,发现PT73、PT64和PT55支架的M1to-M2巨噬细胞转换可能有利于骨修复,而在PT46和PT37组中观察到的恒定M1极化可能导致骨修复失败。

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5.PT支架体外和体内降解阶段的匹配

于是作者首先通过SEM-EDS研究了植入体内后4、10和16周支架降解的表面形态和相应的元素分布,将4、10和16周后体内PT支架的元素组成和降解的变化分别与体外的早期 (D1) 、中期 (D2) 和晚期 (D3) 对应起来。

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6.体外PT支架降解不同阶段的巨噬细胞极化切换

在体外,研究团队将RAW264.7巨噬细胞与不同降解阶段的支架共培养,研究支架降解对巨噬细胞极化和细胞因子分泌的生物学影响。通过免疫荧光染色观察M1和M2巨噬细胞marker基因表达并检测M1和M2 marker蛋白表达,对比发现与PT73和PT55支架不同,P37支架巨噬细胞从D1到D3阶段M1 marker基因表达升高,M2 marker基因降低,促炎IL-6和TNF-α 表达升高。使用ALP活性检测表明在D2和D3阶段用PT37支架培养的巨噬细胞二1212显著抑制成骨细胞ALP活性,而在D2和D3阶段用PT73和PT55支架二1212显著增强ALP活性。

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7.PT支架降解阶段对体内巨噬细胞极化的影响

体内实验使用免疫荧光染色研究了PT支架内巨噬细胞的分布和极化。观察到与体外培养实验中一致的巨噬细胞转换的模式。 

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8.RNA-seq验证降解D2阶段PT支架对巨噬细胞极化的影响

为了更好地了解降解的支架对巨噬细胞极化的生物学作用,研究团队进行了RNA测序 (RNA-seq),以分析在降解的D2阶段用PT55和PT37支架体外培养的巨噬细胞中的基因表达。差异基因GO富集和网络分析表明,在PT37 D2组中,免疫反应,防御反应,对外部刺激功能的反应和急性炎症反应均显着提高。这些功能注释显示,与D2阶段的PT55支架相比,D2阶段的PT37支架在巨噬细胞中诱导了强烈的免疫反应和急性炎症反应。KEGG分析显示,参与免疫系统、感染性疾病和信号12分子和相互作用途径的基因富集; TNF信号通路、NFkappa B信号通路和同种异体移植排斥通路显著上调 (图8D和F)。值得注意的是,吞噬体通路也是PT37 D2组中上调的通路之一,这表明吞噬功能和吞噬体通路可能有助于用PT支架培养的巨噬细胞的极化。

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9.降解产物吞噬和吞噬体形成对巨噬细胞氧化应激和极化的影响

由于KEGG通路的富集提示吞噬功能和吞噬体通途可能在巨噬细胞对降解支架的反应中发挥重要作用,研究团队针对吞噬功能进行了探究,发现PT37组溶酶体的数量和荧光强度更高,并且观察到在PT37 D2支架上培养的巨噬细胞中的一些溶酶体的聚集,在D2阶段用PT37支架培养的巨噬细胞中的吞噬体明显大于用其他PT支架培养的巨噬细胞中的吞噬体。同时,PT37支架在D2阶段显著促进了ROS产生酶NOX2的表达,并抑制了ROS消除酶SOD1的表达 。流式细胞术分析证实,在D2阶段用PT37支架培养诱导巨噬细胞产生的ROS高于其他结痂。

为了进一步确定在D2阶段PT37支架的DPs是否诱导了巨噬细胞中观察到的反应应激和M1极化,作者用氯丙嗪 (CPM,内吞抑制剂) 或latrunculin B (LcB,吞噬抑制剂) 预处理巨噬细胞2小时,发现LcB对吞噬作用的抑制明显减轻了在D2阶段用PT37支架培养的巨噬细胞的M1极化。并且用CPM和LcB进行预处理后,在D2阶段用PT37支架培养的巨噬细胞中降低NOX-2的表达。

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总结:

本研究揭示了可降解骨支架生物降解的动态模式高度协调免疫反应,从而决定了骨再生的成功。因此,通过评估生物材料在整个降解过程中对免疫反应和骨再生的生物效应,有必要开发更具前景的骨再生生物材料。

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