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文章的题目，是《Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods》，

文章发表在Nature Biotechnology 杂志的 2020 年 4 月刊上

通讯作者是 Joshua Levin，他是美国，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所，高级组长和研究科学家。

研究背景

实验内容的第一部分，参与比较的 scRNA-seq 方法和选定的样本

作者一共分析了7种方法。

这7种方法，分别是Smart-seq2, CEL-Seq2, sci-RNA-seq, 10x Chromium, Drop-seq, Seq-Well, 和 inDrops

在这7种方法中，Smart-seq2和CEL-seq2是基于微孔板的方法，并且是低通量的分析方法。

Sci-RNA-seq是基于微孔板的组合的方法，来隔离细胞，并且标识细胞的，它是高通量的分析方法

10x Chromium、Drop-seq、和inDrops，是基于微流控产生的油包水的方法，来隔离细胞。并且，是用带barcode序列的引物微珠来标识细胞的，是高通量的方法

而Seq- Well，是通过带微孔的芯片，来隔离细胞。再用微珠来标识细胞，是高通量的方法

作者取了三种样本，来供分析。

第一种，是人和小鼠的两种细胞系的培养细胞，进行混合，得到混合的细胞，拿来做单细胞测序。之所以要用两个物种的细胞，核心是想看最后实验中双细胞的数量占比。因为得到的reads有了物种序列的差异，就很容易分辨，到底这个序列是序列，还是小鼠的序列。在被读到的一个细胞barcode中，人的细胞与鼠的细胞，有没有混在一起。

第二种，是人的外周血单核细胞，也就是PBMC，用这个样本，好处是这些细胞天然就是分离的，细胞与细胞之间没有粘连，这可以排除用组织来做实验时，会引入的细胞消化过程所引入的问题。

第三种，是小鼠的脑皮层细胞核。之所以选用小鼠的脑皮层细胞的细胞核，是因为小鼠的脑皮层的单细胞分析，常用细胞核作为样本进行分析的。我这里补充一下，脑皮层的细胞，有相当大的一部分是细长的条型的，或者是星型的多角的状态的，所以用圆球型的细胞核，来代替形状各异的细胞做单细胞实验，是一种较为方便的方法。

用这三种类型的样本，在一个中心的六个独立实验室中生成了36个文库。

实验内容的第二部分，scumi 计算管道允许跨任何 scRNA-seq 方法进行统一分析

为了统一地分析几种实验方法得到的实验数据，作者开发了一种新的“通用”计算管道，以消除现有管道引入的处理差异。

作者这把个计算管道命名为“scumi”,是single-cell RNA-sequencing with UMI的首字母缩写。

这个计算管道，从 FASTQ 文件作为输入开始，并生成用于下游分析的基因-细胞表达计数矩阵。

接下来是要过滤掉低质量的细胞。

这点在比较几种方法时，尤其重要。目的是要确保对所有方法都公平，而且不那么主观。

用更多的测序深度，有可能提供更好的结果。但是为了搞清哪种方法的reads的信息含量更高，作者先对每种方法的每个细胞取相同的reads数。

这带来了相对具有更高比例的有信息含量的reads的方法，

作者通过几个关键指标评估这些方法

1、核基因组，和线粒全基因组的，结构，和比对

2、捕捉RNA分子的敏感性

3、在混合细胞的实验中，分析了多细胞的范围

4、它们在估计表达方面的技术精度，和重现性

5、在细胞类型中找出有意义的生物学差异的能力

实验内容的第三部分，Read 结构和比对揭示了方法之间的效率差异

这是各各个方法得到的 Reads 比对到的位置.

三张图，分别是对

细胞混合物、

PBMC、

和鼠脑皮层细胞，这三种样本的检测结果。

图中，每一根立柱，是一个实验的结果，

相互靠近的两个柱子，是对一个样本的2个重复实验。

图中，柱子中灰色的的部分，是对应于外显子的reads

土黄色的部分，是对于内含子的部分，

其它还有基因间的部分，和比对结果模糊的部分，和无法比对的部分。

其实，一般来说，最有用的部分，首先是比对到外显子的reads，而且大多数的研究，往往只用比对到外显子reads。

其次是比对到内含子的reads，在细胞核的研究中用得较多。

那么在混合细胞样本的实验中，Smart-Seq2的两个重复实验，和inDrops的一个实验，得到了比例最高的外显子reads，这三个的外显子reads数达到50%以上.

而sci-RNA-seq表现最差，外显子的比例是28.7%和29.4%。

与混合细胞样本相比，PBMC的外显子比例较低，只有inDrops的一个实验达到了46%。

脑皮层的细胞核的样本，得到的reads中，内含子相对于外显子的比例，要更高。

这和作者的预期是一致的。因为细胞核中包含了更多的没有经过剪切的转录本。

实验内容的第四部分，不同实验中方法灵敏度的相似相对排名

由于 scRNA-seq 方法从少量有限的 RNA 输入开始，一个关键的质量指标是灵敏度或捕获 RNA 分子的能力。

作者通过测量数据集中每个细胞检测到的 UMI 或基因的数量来评估每种方法的敏感性。

这张图，是6种方法检测到的每个细胞中的UMI数量。

说明一下，因为Smart-seq2方法本身没有UMI，所以这张图里面没有Smart-seq2的结果。

我们看这张图，CEL-Seq2方法，因为输入的细胞数少，所以每个细胞得到的UMI数量明显多于其它几种方法。

在剩下的5种高通量方法中，10x Chromium的方法，得到的每个细胞的UMI数量是最多的。

这是混合细胞，各方法检测到的每个细胞中的基因数量。

很明显，Smar-seq2和CEL-seq2这两个低通量的方法，检测到的每个细胞中的基因数最多。

剩下的5种方法中，10x Chromium方法得到的基因数量最多。

Indrops和Drop-seq方法得到的基因数量最少。

再看这组图，这组是PBMC样本得到的结果，

上面两个图是测到的单个细胞的UMI数量的分布情况

下面两个图是测到的单个细胞的基因的数量的分布情况。

大体上，是和前面混合细胞的情况是差不多的。

低通量的办法，也就是Smart-seq2和CEL-seq2，每个细胞可以测到更多的UMI数量，和更多的基因数量。

在高通量的办法中，10x Chromium的方法可以测到更多的UMI数量，和更多的基因数量。

这两张图，是小鼠脑皮质细胞核样本做的结果，

和预期一样，低通量的Smart-seq2方法，每个细胞检测到了最多的基因数量。

而几个高通量的方法中，10x chromium方法得到了最多的UMI数量，和最多的基因数量。

接下来，作者分析了各个方法，在每个细胞取相同的测序深度下，在每个细胞中，能够检测到的基因数量。

这里，每张图的横轴是测的reads数，纵轴是测到的基因数

可以看到左边的两张图是两个低通量方法的结果，两个低通量方法的结果差别不太大，

右边的两张图是高通量方法的结果。在高通量方法中，10x Chromium的方法，在相同的测序深度条件下，可以测到更多的基因。

这是在每个细胞取相同的测序深度下，在每个细胞中能检测到的UMI数量。

在高通量的条件下，10x Chromium的方法是在每个细胞中能检测的UMI数量最高的。

作者进一步分析了各个方法中，每个细胞中测到的UMI数量，与测到的基因数量的关系。

图中，横轴是一个细胞测到的UMI数量，纵轴是一个细胞测到的基因数量。

分析结果显示，每个细胞中测到的UMI数量，与测到的基因数量有线性关系。

实验内容的第五部分，混合实验能够检测多细胞和来自其他细胞的读数

接下来是看一个细胞barcode对应到多细胞的情况。

这是用小鼠的细胞，和人的细胞，混合后，进行检测。通过检测一个细胞barcode中，是否包含两个物种的序列，来判断多细胞的情况。

图中，横轴是细胞数量，纵轴是多细胞的比例

结果，所有的检测结果，多细胞的比例都低于3.5%，除了一个inDrops的实验结果是8.0%。

并且，两个低通量的方法，检测到的多细胞的比率最低。因为这两个方法，都是通过流式细你发仪将单个细胞放到平板的每个孔中的。

接下来，作者分析了这7种方法，各自的结果中，每种细胞混杂的来自其他细胞的污染。

这里的7张图，就是7种方法，每张图的横轴，是一个细胞中来自人类的基因数，纵轴是来自小鼠的基因数。

如果一个细胞中的序列很纯粹，那么代表这个细胞的点，就会要么出现在横轴上，要么出现在纵轴上，

反之，如果这个细胞中混有另一个物种的序列，那么这个点的位置，就会靠近图中央。

也就是说，一个方法中的两个物种的细胞，它们各自的拟合线越平，或者越直，越靠近X轴或Y轴，则这个方法中被污染的reads数越少。

在低通理的两个方法中，Smart-seq2的拟合线的坡更平，因此Smart-seq2的表现比CEL-seq2的表现更好。

高通量的方法中，inDrops方法的拟合线是最平直的。inDrops方法在这一项上的表现最好。

实验内容的第六部分，基因表达定量的技术精度、重现性和准确性

为了评估混合细胞实验的技术精度，该实验由在受控条件下培养的两个同质细胞系组成，作者还比较了 scRNA-seq 数据的变化，预计在这种情况下主要由技术变化驱动。

这些变化通常符合泊松分布。

而CEL-Seq2、inDrops 和 Drop-seq 始终具有相对较低的超出泊松分布之外的变异系数。

也就是说，这三种方法的实验结果可重复性较高。

而Smart-seq2有很高的超过泊松分布之外的变化。也就是说，这种方法的实验结果可重复性较低

实验内容的第七部分，基因表达定量的技术精度、重现性和准确性

在 scRNA-seq 研究的众多生物学特征中，最突出的实用例子之一，就是通过聚类 scRNA-seq 来识别不同的细胞类型。

这张图是4种检测方法分别得的PBMC样的本的t-SNE图。

各种方法，分辨出各种细胞簇的能力有所不同。

在PBMC样本中，10x Chromium 和 inDrops 的表现良好。

通常，大多数方法成功地找出了 PBMC 中丰富的细胞类型。

但是，对于稀有的细胞类型，如浆细胞样树突细胞、和血小板，这些细胞在不同的方法中，以不同的比例被捕获。

这是用点阵图，来展示各种方法检出的各细胞簇的多少。

对于低通量的方法，没有足够的细胞数量，来找出稀有的细胞类型。

在高通量的检测方法中，10x Chromium在检出各种细胞类型上的表现最佳。

小鼠皮层，也具有明确定义的多种细胞类型。

这是用各种方法检测得到的 t-SNE 图。

在用于分析的4种方法中，3种方法找到了要找的各种细胞类型。

而sci-RNA-seq这个方法，没有找到全部的细胞类型。

这是脑皮层样本的点阵图，图中点的颜色代表了找到特定类型细胞的确信度。

可以看到，在这其中，sci-RNA-seq的样本找不到少突胶质祖细胞，也找不到小胶质细胞

实验内容的第八部分，跨方法的汇总数据分析增强了生物信号和一致性

考虑到各个检测方法，没有检测到部分细胞类型，可能的原因是，

1、由于实验的问题，文库不包含来某些细胞类型的cDNA

2、考虑到测序深度和细胞数量，来自这些细胞的数据质量不足以识别这些细胞

作者接下来把所有的、各个检测得到的细胞数据进行合并分析。

左图是这个合并分析得到的t-SNE图。

右图是分析得到的经果，可以看到，在合并之后，各个方法都分析出了那些稀有的细胞类型。

这是几种方法单独分析，和合并分析，两者的结果对比。

纵轴是合并分析的结果。

横轴，是8个实验的单独的结果。

格子中的红色，是一致性。

我们可以看到

10x Chromium V2的结果，单独与合并有最好的一致性。其次是10x Chromium V3的结果。

对皮层细胞核做同样的分析，分析结果是，10x Chromium有最好的一致性。

这是几种参与比较的方法的评比结论。

首先，基于微孔板两种低通量检测方法的灵敏度是最好的，明显高于其它的几种高通量的检测方法。

在识别细胞类型这一点上，10x Chromium的结果是最好的。

并且，因为10x Chromium的方法做了很好的商业化的整合包装，所以它的易用性也是最好的。

其它的特点，大家可以慢慢细看这个表。